Блог

Aug 04, 2023

Эффективная модификация и подготовка кольцевой ДНК для экспрессии в культуре клеток

Том коммуникативной биологии

Биология связи, том 5, Номер статьи: 1393 (2022) Цитировать эту статью

6100 Доступов

2 цитаты

39 Альтметрика

Подробности о метриках

ДНК-плазмиды являются важным инструментом для доставки и экспрессии РНК и белков в экспериментах на клеточных культурах. Получение плазмид обычно включает трудоемкий процесс бактериального клонирования, проверки и очистки. Хотя экспрессирующие плазмиды можно разработать и заказать у контрактных производителей, стоимость может оказаться непомерно высокой, если требуется большое количество плазмид. Мы разработали эффективный полностью синтетический метод и протокол, который позволяет производить кольцевую ДНК, содержащую элементы экспрессии, готовые к трансфекции всего за 3 часа, тем самым устраняя этапы бактериального клонирования. Протокол описывает, как взять линейный двухцепочечный фрагмент ДНК, эффективно циркулировать и очистить этот фрагмент ДНК с минимальными затратами времени. В качестве доказательства этого принципа мы применили Circular Vector, экспрессирующий сконструированную направляющую РНК первичного редактирования (epegRNA) в культуре клеток, и продемонстрировали соответствие и даже превосходство эффективности этого метода по сравнению с направляющими, экспрессируемыми плазмидами. Скорость приготовления метода, низкая стоимость и простота использования сделают его полезным инструментом в приложениях, требующих экспрессии коротких РНК и белков.

Существует множество методов получения и доставки РНК и белков для временной экспрессии в клеточных культурах1. В этом исследовании мы представляем новый и эффективный метод подготовки. В качестве демонстрации мы опишем использование нашего метода в контексте приложения для редактирования генов. Однако, поскольку принцип, лежащий в основе этого метода, является общим, этот метод может быть полезен для различных целей и приложений, требующих экспрессии РНК и белков. Хотя мы обсудим конкретную реализацию редактирования генов и сравним наш метод с некоторыми существующими методами подготовки, цель этой статьи — представить новый подход к подготовке векторов экспрессии в лабораторных условиях, а не более эффективный метод редактирования генов, как такой.

Три наиболее распространенных подхода, которые облегчают редактирование генов при доставке в клетки: (I) одна или несколько плазмид2, кодирующих Cas9 и другие дополнительные белки, а также реализация направляющей РНК, подходящей для традиционного CRISPR/Cas9, редактирования оснований, первичного редактирования или других методов3,4 ,5,6; (II) мРНК Cas9 и гидовая РНК7; (III) Белок Cas9 в комплексе с направляющими РНК8. В настоящее время используются различные способы доставки вышеупомянутых конструкций для редактирования генов. Выбор метода доставки будет зависеть от конкретных требований и предпочтений исследователя, который может включать электропорацию9,10, липофекцию11, прямую физическую трансфекцию12, векторную доставку на полимерных частицах и микроносителях13, а также варианты вышеупомянутых методов.

Подход (I), редактирование генов с использованием трансфекции плазмид для временной экспрессии, обычно используется из-за его концептуальной простоты, простоты обращения и стабильности плазмид. Однако приготовление плазмид является трудоемким и трудоемким процессом, который обычно занимает 2 дня2 (см. типичные этапы клонирования бактерий в дополнительном примечании 1).

Мы разработали эффективный полностью синтетический метод и протокол, который позволяет производить кольцевую ДНК, содержащую элементы экспрессии, готовые к трансфекции, всего за 3 часа, тем самым устраняя этапы бактериального клонирования. Циркуляризованная ДНК устойчива к деградации экзонуклеазой в цитоплазме14. Линейной ДНК не хватает такой стабильности, что является существенным препятствием для ее использования для доставки генов. Более того, наш метод использует это различие в свойствах, используя экзонуклеазу для переваривания непрореагировавших или неправильно прореагировавших линейных фрагментов ДНК, тем самым очищая кольцевую ДНК.

Мы определили, что практический диапазон длины вектора экспрессии находится между 450 и 950 п.н., при этом эффективность преобразования входной линейной двухцепочечной ДНК (дцДНК) в кольцевые векторы экспрессии достигает 62%; метод можно было бы использовать и с меньшей эффективностью для несколько более длинных фрагментов. Для краткости, последовательности и во избежание путаницы с описанием этапов подготовки и конечного продукта в этой статье мы будем называть эту конструкцию и метод вектора экспрессии кольцевой ДНК круговым вектором, написанным с заглавной буквы и курсивом.