Новости

Aug 05, 2023

Вакциния

Том «Природные коммуникации»

Nature Communications, том 14, номер статьи: 1770 (2023) Цитировать эту статью

2697 Доступов

66 Альтметрика

Подробности о метриках

Направленная эволюция бактериальных или дрожжевых систем дисплея успешно использовалась для улучшения стабильности и экспрессии рецепторов, связанных с G-белком, для структурных и биофизических исследований. Тем не менее, некоторые рецепторы не могут быть задействованы в микробных системах из-за их сложного молекулярного состава или неблагоприятных свойств лигандов. Здесь мы сообщаем о подходе к развитию рецепторов, связанных с G-белком, в клетках млекопитающих. Для достижения клональности и единообразной экспрессии мы разрабатываем систему вирусной трансдукции на основе вируса коровьей оспы. Благодаря рациональному дизайну библиотек синтетической ДНК мы сначала создаем рецептор нейротензина 1 для обеспечения его высокой стабильности и экспрессии. Во-вторых, мы демонстрируем, что рецепторы со сложной молекулярной архитектурой и большими лигандами, такие как рецептор паратиреоидного гормона 1, могут быть легко развиты. Важно отметить, что функциональные свойства рецепторов теперь могут развиваться в присутствии сигнальной среды млекопитающих, что приводит к появлению вариантов рецепторов, демонстрирующих повышенную аллостерическую связь между сайтом связывания лиганда и интерфейсом G-белка. Таким образом, наш подход дает представление о сложном молекулярном взаимодействии, необходимом для активации GPCR.

Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), составляют самое большое семейство интегральных мембранных белков и участвуют в регуляции многих биологических процессов1. GPCR воспринимают большое количество лигандов, от небольших молекул до крупных белков, на своей внеклеточной стороне. Чтобы реализовать свою функцию, GPCRs выбирают континуум конформационных состояний, что приводит к уровням от отсутствия активности до максимальной активности. Лиганды стабилизируют отдельные конформации, которые удерживают рецептор либо в неактивном состоянии (в случае обратных агонистов), либо в активном состоянии (в случае агонистов)2. Конформационные изменения, индуцированные агонистом в лиганд-связывающем кармане, передаются на внутриклеточную поверхность рецептора и приводят к активации гетеротримерных G-белков путем замены GDP на GTP в субъединице Gα. Как следствие, субъединицы Gα и Gβγ диссоциируют и могут активировать последующие сигнальные процессы3,4. Учитывая их широкую физиологическую значимость, GPCR являются важными мишенями для лекарств1, и понимание структурно-функциональных механизмов, приводящих к активации GPCR, имеет решающее значение для будущей разработки лекарств. Хотя конформационная гибкость необходима для правильного функционирования рецептора, она является препятствием для экспериментального определения белковых структур. Это послужило мотивацией значительных инженерных усилий, направленных на то, чтобы сделать GPCR пригодными для структурных исследований.

Ранее мы разработали несколько стратегий, используя направленную эволюцию для улучшения биофизических свойств GPCRs5,6,7,8. Направленная эволюция направлена ​​на ускорение процесса естественной эволюции, т. е. обогащение желаемых признаков, закодированных в пуле генетических вариантов, посредством итеративных раундов генной диверсификации и отбора. Таким образом, функция белка может быть изменена или создана de novo, и, таким образом, направленная эволюция стала мощным методом разработки новых молекулярных инструментов и терапевтических средств, но в основном применяется к растворимым белкам. Чтобы распространить эту методологию на GPCR, были использованы микробные организмы, такие как бактерии и дрожжи. Путем трансформации с помощью плазмид они могут занять в среднем одну копию, так что после того, как плазмида установит количество копий, каждая микробная клетка все еще остается «клональной». Экспрессия GPCR в функциональной форме в плазматической мембране дрожжей или внутренней мембране E. coli была показана5,8,9, и, таким образом, гарантируется строгое сочетание фенотипа и генотипа, что является ключевым требованием для направленной эволюции. Более того, у микробов можно достичь высоких скоростей трансформации, чтобы эффективно представлять разнообразные библиотеки генов. Используя отбор, основанный на количестве лиганд-связывающих и, следовательно, функциональных рецепторов в мембране, были созданы различные хорошо экспрессирующиеся и стабильные варианты GPCR, которые сыграли важную роль в структурных исследованиях и проектах по поиску лекарств10,11,12,13,14,15, 16,17.