Новости

Aug 06, 2023

Дизайн люцифераз de novo с использованием глубокого обучения

Природа том 614, стр.

Nature, том 614, страницы 774–780 (2023 г.) Процитировать эту статью

68 тысяч доступов

4 цитаты

495 Альтметрика

Подробности о метриках

При разработке ферментов de novo предпринимались попытки ввести активные центры и субстрат-связывающие карманы, которые, как ожидается, будут катализировать интересующую реакцию, в геометрически совместимые нативные каркасы1,2, но были ограничены отсутствием подходящих белковых структур и сложностью нативной белковой последовательности. – структурировать отношения. Здесь мы описываем основанный на глубоком обучении подход «всесемейных галлюцинаций», который генерирует большое количество идеализированных белковых структур, содержащих разнообразные формы карманов, и разработанные последовательности, которые их кодируют. Мы используем эти каркасы для создания искусственных люцифераз, которые избирательно катализируют окислительную хемилюминесценцию синтетических субстратов люциферина дифенилтеразина3 и 2-дезоксикоэлентеразина. Разработанные активные центры размещают аргинин-гуанидиниевую группу рядом с анионом, который развивается во время реакции, в связывающем кармане с высокой комплементарностью формы. Для обоих субстратов люциферина мы получили сконструированные люциферазы с высокой селективностью; наиболее активным из них является небольшой (13,9 кДа) и термостабильный (с температурой плавления выше 95 °С) фермент, обладающий каталитической эффективностью по дифенилтеразину (ккат/Км = 106 М-1 с-1), сравнимой с таковой у нативные люциферазы, но с гораздо более высокой субстратной специфичностью. Создание с нуля высокоактивных и специфичных биокатализаторов с широким применением в биомедицине является ключевой вехой в компьютерном проектировании ферментов, и наш подход должен позволить создавать широкий спектр люцифераз и других ферментов.

Биолюминесцентный свет, получаемый в результате ферментативного окисления субстрата люциферина люциферазами, широко используется для биоанализов и визуализации в биомедицинских исследованиях. Поскольку источник возбуждающего света не требуется, в темноте генерируются люминесцентные фотоны; это приводит к более высокой чувствительности, чем флуоресцентная визуализация на моделях живых животных и в биологических образцах, в которых автофлуоресценция или фототоксичность вызывают беспокойство4,5. Однако разработка люцифераз в качестве молекулярных зондов отстает от разработки хорошо разработанных наборов инструментов для флуоресцентных белков по ряду причин: (i) идентифицировано очень мало нативных люцифераз6,7; (ii) многие из тех, которые были идентифицированы, нуждаются в множественных дисульфидных связях для стабилизации структуры и, следовательно, склонны к неправильному сворачиванию в клетках млекопитающих8; (iii) большинство нативных люцифераз не распознают синтетические люциферины с более желательными фотофизическими свойствами9; и (iv) мультиплексная визуализация для параллельного отслеживания нескольких процессов с использованием взаимно ортогональных пар люцифераза-люциферин была ограничена низкой субстратной специфичностью нативных люцифераз10,11.

Мы стремились использовать дизайн белков de novo для создания небольших, высокостабильных, хорошо экспрессируемых в клетках люцифераз, специфичных для одного субстрата и не нуждающихся в кофакторах для функционирования. Мы выбрали синтетический люциферин, дифенилтеразин (ДТЗ), в качестве целевого субстрата из-за его высокого квантового выхода, смещенной в красную сторону эмиссии3, благоприятной фармакокинетики in vivo12,13 и отсутствия необходимых кофакторов для излучения света. Предыдущие попытки компьютерного проектирования ферментов в основном перепрофилировали каркасы нативных белков в Банке данных белков (PDB)1,2, но существует мало нативных структур со связывающими карманами, подходящими для DTZ, и эффекты изменений последовательности нативных белков могут быть непредсказуемыми (созданные спиральные пучки также использовались в качестве каркасов для ферментов14,15,16, но их количество ограничено, и большинство из них не имеют карманов, подходящих для связывания DTZ). Чтобы обойти эти ограничения, мы намеревались создать большое количество небольших и стабильных белковых каркасов с карманами подходящего размера и формы для DTZ и с четкими связями последовательность-структура, чтобы облегчить последующее включение активного центра. Чтобы идентифицировать белковые складки, которые способны содержать такие карманы, мы сначала состыковали DTZ с 4000 нативными белками, связывающими малые молекулы. Мы обнаружили, что многие складки, подобные ядерному фактору транспорта 2 (NTF2), имеют связывающие карманы с соответствующей комплементарностью формы и размером для размещения DTZ (розовые штрихи на рис. 1e), и, следовательно, выбрали NTF2-подобное суперсемейство в качестве целевой топологии.